Amplification soustractive d’ARNm basée sur la transcription (STAR)
Alethia cherche à découvrir des gènes liés à des maladies et à valider leur utilisation comme cibles dans le développement de produits thérapeutiques. Tout changement dans l’état d’une cellule, tel que ceux qui se produisent dans un état pathologique ou durant un traitement médicamenteux, est provoqué par des altérations de l’activité de divers gènes dans la cellule, entraînant la modification de l’expression de certains ARNm. Les différences d’activité génétique entre deux cellules ou plus, mesurées par les ARNm exprimés, constituent ce que l’on appelle l’expression différentielle.
Une cellule humaine typique exprime environ 20 à 30 % des gènes du génome humain sous la forme d’ARNm distincts, dont près de la totalité (99 %) sont très peu abondants. Bien que ces ARNm rares représentent chacun moins de 0,005 % de l’ensemble, collectivement, ils constituent environ la moitié de tous les ARNm d’une cellule typique. Les différences fonctionnelles et morphologiques entre les types cellulaires sont dues à l’expression différentielle des gènes dans des cellules ayant le même génome. En raison de ces complexités, la mise en évidence des séquences d’ARNm différentiellement exprimées dans deux types cellulaires ou plus peut s’avérer terriblement ardue.
Alethia a reconnu la nécessité de nouvelles techniques permettant de réduire la complexité des ARNm cellulaires à un nombre raisonnable de séquences différentiellement exprimées et de produire des banques de séquences simplifiées directement utilisables pour la validation.
Technique de découverte STAR
En accord avec cette mission, Alethia exploite une technique d’amplification soustractive d’ARNm basée sur la transcription appelée STAR (Subtractive Transcription-based Amplification of mRNA) pour la découverte de séquences d’ARNm exprimées différentiellement, y compris les plus rares. Les ARNm de chaque échantillon cellulaire sont utilisés pour la préparation de banques d’ADNc, à partir desquelles des ARN simple brin (+) sens cibles et des ADN simple brin (-) antisens entraîneurs peuvent être synthétisés. L’ARN cible contient des séquences terminales permettant l’amplification dans un processus d’amplification d’ARN. La technique STAR amplifie préférentiellement les séquences qui sont présentes dans l’ARN cible et absentes ou moins abondantes dans l’ADN entraîneur par une combinaison d’hybridation soustractive et d’amplification d’ARN.
La technique STAR se démarque par sa capacité à mettre en évidence des séquences différentiellement exprimées d’une manière distincte des méthodes antérieures. Contrairement aux autres approches soustractives, qui nécessitent la réhybridation d’un ADN double brin pour l’amplification par PCR, la technique STAR utilise l’ADN d’une banque pour inactiver l’ARN simple brin d’une autre banque, ce qui permet l’amplification linéaire des ARN exprimés différentiellement qui restent. C’est ce changement de paradigme de l’approche soustractive qui permet la préservation et la détection subséquente des séquences rares exprimées différentiellement.
La technique STAR se distingue des autres méthodes commerciales utilisées pour l’analyse de l’expression différentielle par son recours à une étape d’amplification d’ARN dont la cinétique est linéaire plutôt qu’à une amplification d’ADN ayant une cinétique exponentielle. Ceci réduit l’amplification préférentielle de certaines séquences dans un mélange, un phénomène que l’on observe avec les techniques basées sur la PCR. En outre, l’amplification basée sur la transcription est reconnue pour être la moins sujette à des distorsions dans la préparation de sondes pour l’analyse de l’expression des ARNm avec des puces à ADN.
La technique STAR étant une méthode préparative, elle possède des avantages distinctifs par rapport aux diverses versions commerciales d’études de l’expression qui sont généralement utilisées à des fins analytiques. Les changements survenant dans le modèle de la maladie entraînent une expression différentielle qui est reflétée dans les produits obtenus au moyen de la technique STAR. Par conséquent, alors que d’autres méthodes ne procurent que des données sur l’expression, la technique STAR produit du matériel informatif, qui peut être utilisé directement pour la validation de nouvelles cibles thérapeutiques.